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    AAT Bioquest——Caspases酶系列1:底物及抑制剂

    发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-06-28     
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    什么是胱天蛋白酶?

    胱天蛋白酶(Caspases)是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体,例如TNF-α 受体,FasL受体,TLR和死亡受体,以及Bcl-2和凋亡抑制剂(IAP)蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号(外部或内在)刺激被激活,即会参与执行下游蛋白底物的水解作用,并触发一系列事件,导致细胞分解,死亡,吞噬作用和细胞碎片的清除。

     

    人Caspases酶

    人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类:第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成,他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成,而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成(表1)。

     

    表1.人胱天蛋白酶的功能分类

    细胞死亡途径
    半胱天冬酶类型
    酵素
    物种
    细胞凋亡
    启动器
    Caspases 2
    人与鼠
    细胞凋亡
    启动器
    Caspases 8
    人与鼠
    细胞凋亡
    启动器
    Caspases 9
    人与鼠
    细胞凋亡
    启动器
    Caspases 10
    人的
    细胞凋亡
    效应器
    Caspases 3
    人与鼠
    细胞凋亡
    效应器
    Caspases 6
    人与鼠
    细胞凋亡
    效应器
    Caspases 6
    人与鼠
    细胞焦亡
    炎性的
    Caspases 1
    人与鼠
    细胞焦亡
    炎性的
    Caspases 4
    人的
    细胞焦亡
    炎性的
    Caspases 5
    人的

     

    启动器Caspase和效应器Caspase

    根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用,胱天蛋白酶可分为两类:启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点,Caspase酶的识别位

     


     

    凋亡启动器Caspase酶,例如caspase-2,-8,-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物(DISC)是必不可少的,并且在激活后,Caspase-8激活下游效应子Caspase(例如Caspase 3)并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3,-6和-7虽然不负责启动级联途径,但是当被激活时,它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3(CPP32 / apopain)是关键效应器,因为它放大了来自启动器Caspase的信号,使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测,可以检测Caspase-3的活性。

     

     Caspase酶底物和抑制剂

    Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成:Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同,一般由三个或四个氨基酸组成(表2)。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基(Ac)碳苯甲氧基(Z)基团修饰,以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点,释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用,其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

     

    表2. Caspase底物及其序列

    多肽
    氨基酸序列
    对应的Caspase的种类
    IETD
    Ile-Glu-Thr-Asp
    Caspase 8,颗粒酶B
    DEVD
    Asp-Glu-Val-Asp
    Caspase 3、6、7、8或10
    LEHD
    Leu-Glu-His-Asp
    Caspase 9
    VAD
    Val-Ala-Asp
    Caspase 1、2、3、6、8、9或10


    Caspase的显色底物

    Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成,常见的生色团有pNA(对硝基苯胺或4-硝基苯胺),可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

     

    表3. Caspase的显色底物

    底物
    Caspase
    吸收(nm)
    颜色
    规格
    货号
    Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 *
    半胱天冬酶3
    405 nm
    黄色
    5 mg
    13405
    Z-DEVD-pNA
    半胱天冬酶3
    405 nm
    黄色
    5 mg
    13422
    Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 *
    半胱天冬酶8,颗粒酶B
    405 nm
    黄色
    5 mg
    13413

     

    Caspase的荧光底物

    Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团,例如7-氨基-4-甲基香豆素(AMC),7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC), Rhodamine 110(R110)或ProRed?620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物(例如AMC和AFC)更敏感,但由于两步裂解过程,其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定,而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

     

    Caspase的荧光底物.jpg

    图.从左到右,分别是AMC(7-氨基-4-甲基香豆素),AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素),Rhodamine 110(R110)和ProRed?620的激发和发射光谱。

     

    表4.荧光半胱天冬酶底物。

    底物名称
    对应的Caspase
    Ex(nm)
    Em(nm)
    ε?
    Φ?
    规格
    货号
    Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 *
    半胱天冬酶3、7
    376
    482
    17000
    0.53
    5mg
    13401
    Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 *
    半胱天冬酶3、7
    341
    441
    19000
    N / D
    5mg
    13402
    Z-DEVD-AFC
    半胱天冬酶3、7
    376
    482
    17000
    0.53
    5mg
    13420
    Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 *
    半胱天冬酶3、7
    341
    441
    19000
    N / D
    5mg
    13421
    Z-DEVD-ProRed?620
    半胱天冬酶3、7
    532
    619
    N / D
    N / D
    1mg
    13433
    (Z-DEVD)2 -R110 * CAS 223538-61-2 *
    半胱天冬酶3、7
    500
    522
    80000
    N / D
    1mg
    13430
    Z-DEVD-ProRed?620
    半胱天冬酶3、7
    532
    619
    N / D
    N / D
    1mg
    13433
    Ac-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 *
    半胱天冬酶8,颗粒酶B
    376
    482
    17000
    0.53
    5mg
    13410
    交流电-IETD-AMC
    半胱天冬酶8,颗粒酶B
    341
    441
    19000
    N / D
    5mg
    13411
    Z-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 *
    半胱天冬酶8,颗粒酶B
    376
    482
    17000
    0.53
    5mg
    13425

     

    注意

    1. ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数(单位= cm -1-1)。

    2. Φ=水性缓冲液(pH 7.2)中的荧光量子产率

     

    Caspase抑制剂

    Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接,通常,Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列,诸如醛(-CHO)或氟甲基酮(-FMK)的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的,而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用,因此,它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

     

    表5.可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

    抑制剂
    Caspase的种类
    是否可逆
    Ex(nm)
    Em(nm)
    规格
    货号
    Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 *
    半胱天冬酶3、7
    可逆的
    --
    --
    1mg
    13403
    Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 *
    半胱天冬酶8
    可逆的
    --
    --
    5mg
    13412
    mFluor?450-VAD-FMK
    半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10
    不可逆的
    406
    445
    25 tests
    13475
    mFluor?510-VAD-FMK
    半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10
    不可逆的
    412
    505
    25 tests
    13476
    FITC-C6-DEVD-FMK
    半胱天冬酶3、7
    不可逆的
    491
    516
    1mg
    13406
    FITC-C6-DEVD-FMK
    半胱天冬酶3、7
    不可逆的
    491
    516
    100ug
    13408
    FITC-C6-LEHD-FMK
    半胱天冬酶9
    不可逆的
    491
    516
    1mg
    13407
    FITC-C6-LEHD-FMK
    半胱天冬酶9
    不可逆的
    491
    516
    100ug
    13409
    FAM-VAD-FMK
    半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10
    不可逆的
    493
    517
    25 tests
    13470
    SRB-VAD-FMK [磺胺丁胺B-VAD-FMK]
    半胱天冬酶1,2,3,6,8,9,10
    不可逆的
    559
    577
    25 tests
    13472

     

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