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    Jackson SRM应用荧光标记二抗

    发布者:艾美捷科技    发布时间:2020-12-31     
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           艾美捷科技作为Jackson中国区域总代理,将为您提供Jackson的特色优质产品主要包括各种纯化的二抗、标记的二抗(AMCA、 Cy2、FITC、Cy3、TRITC、RRX、TR、Cy5、长臂生物素、辣根酶和碱磷酶标记)、胶体金试剂等。今天主要为您介绍SRM应用荧光标记二抗,看下文介绍:

          如今,科学家们已经研发了多种超分辨率技术,远远超出了衍射极限,能够观察到分子尺度的细节。SRM技术可以将细胞结构解析为亚细胞水平,从而获取有关细胞组分的3D结构的信息,并可以观察到单分子共定位。下面我们来简要概述了时下几种最流行的SRM技术的原理:

           1.受激发射耗竭(STED)显微镜

          STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单,该方法和普通共聚焦显微镜(Confocal)的原理相同。普通Confocal使用单光源,而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签(研究者们以此来定位和观察蛋白)的光,另一个光源发出不同波长的光,用于抑制荧光。这束光是环形的,并且与第一束光有所重叠,因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

    获得STED超分辨率图片并没有那么复杂,用户需要仔细调整参数,才能得到漂亮的结果,否则所得图片和普通confocal没有差别。


    STED.jpg


          使用传统和RESCue受激发射减损显微镜(STED)得到的细胞核膜上核孔复合体的图片。

           STED的原理:

          显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域,这称为点扩散函数(PSF)(见图1),由于PSF的存在,使得常规显微镜无法达到超分辨。


    PSF.png

           图1:在普通光学显微镜中,成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制,防止了射线的精确会聚,从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数(PSF)的大小,或对象在某个点的三维强度分布。在STED中,应用环形炸弹耗尽型激光器,其零点与激发激光焦点的最大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”,从而“抑制了来自零点附近区域的荧光,导致有效PSF的尺寸减小”。

          而受激发射耗竭(STED)显微镜通过限制样品的荧光区域(PSF)产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光,第一个按照常规显微镜激发荧光团(图2A)。第二个激光器称为耗尽激光器(STED激光器),它激发“甜甜圈”形状的激光,其中心的零强度点非常小(?30 nm)(未激发)。除了在甜甜圈的中心处之外,第二激光起到了“关闭”第一激光所产生的外圈荧光,从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处,这有效地降低了PSF,以产生非常小的单分子荧光聚焦区域,从而获得高分辨率图像(图2D)。


    PSF-1.jpg

           图2

          1.单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析,从而导致图像模糊

          2.STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”

          3.饱和耗尽在功能上降低了激励PSF

          4.随之可以解析单个蛋白质

           适用于STED的荧光团偶联抗体:

          为了获得超分辨率,染料必须具有STED激光波长的高发射截面,并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性,具有高的量子产率和对比度,并在目标附近具有足够的标记密度。

          Jackson提供荧光染料标记的二抗,下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用:


    染料
    货号
    AlexaFluor®488
    AlexaFluor®594
    AlexaFluor®647
     

         

            2. 随机光学重建显微镜(STORM)

          最有名的“基于探针”的技术是Betzig等人研发的光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和哈佛大学庄小威实验室发明的随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签,随后使用另一束光来关闭这些荧光标签。不断重复这个过程,生成一系列部分荧光图,最后重建成整个视野的荧光图。,以产生分辨率优于常规方法收集的图像。


    STORM.jpg


          使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM),科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

          Jackson提供适用于dSTORM应用的标记二抗,简而言之,较低强度的激发光激发样品,随机激活少量染料分子。单个发荧光的染料分子足够分散,因此可以计算其点扩散函数的中心,从而推断出染料的确切位置。然后使用第二激光关闭所有分子,并重复该过程。然后,通过重叠每种染料的所有映射点扩展函数,以数学方式生成高分辨率图像。

           用于单分子定位实验的荧光团偶联抗体

     用于单分子定位的最佳染料通常非常亮,并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多种广谱范围内的可靠染料,例如AlexaFluor®488,AlexaFluor®647和Cy™5,可用于这些类型的实验。

           建议用于超分辨率显微镜的荧光染料偶联物:


    STED
    激发波长(nm)
    发射波长(nm)
    Alexa Fluor® 488
    493
    519
    荧光素 / FITC
    492
    520
    Alexa Fluor® 594
    591
    614
    Alexa Fluor® 647
    651
    667

     

    STORM
    激发波长(nm)
    发射波长(nm)
    Alexa Fluor® 488
    493
    519
    Alexa Fluor® 647
    651
    667
    Cy™5
    650
    670

          每种SRM技术都有各自的探针选择要求,Jackson ImmunoResearch提供多种已知在SRM应用中表现良好的荧光标记二抗。应该注意的是,SRM领域变化迅速,因此,建议从专业技术文献中寻求信息,以帮助选择合适的荧光团。

          更多相关Jackson ImmmoResecarchbet9下载网址的SRM应用荧光标记二抗产品详情,欢迎点击查看:超分辨率显微镜分析,荧光抗体该怎么选?

          作为Jackson ImmmoResecarch在中国的区域代理,艾美捷科技有限公司将为中国客户提供最全面的ackson ImmmoResecarchbet9下载网址的SRM应用荧光标记二抗产品以及订制服务,欢迎随时联系我们。


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